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徐念，中科院水生生物研究所硕士。就职于水利部中国科学院水工程生态研究所，从事鱼类资源保护研究。 摘要：长江生物多样性在人为影响下面临严重威胁，物种监测是生物多样性保护的基础，为完善长江水生态监测体系，实现高效无损伤的物种监测，在长江中下游干流3个江段（新滩、安庆和芜湖）采集水样，建立长江水样环境DNA宏条形码物种检测体系并评估其有效性.结果表明：①长江中下游环境DNA宏条形码检测到32个物种，包括20种鱼类、1种水生哺乳动物（长江江豚）和11种陆生动物，其中鱼类物种包括鲤形目、鲇形目、鲈形目和鲱形目，其种数占鱼类总种数的比例分别为60%、25%、10%和5%.②长江中下游渔获物中资源量居首位的鲤形目在环境DNA调查中序列数最多，占鱼类总序列的96.2%，其次为鲱形目（占比为3.5%），鲇形目和鲈形目占比较低，分别为0.2%和0.1%，4个类目序列相对丰度与渔获物种资源量组成差异较大.③环境DNA调查次数约占传统渔获物调查次数的几十至几百分之一，采样时间不足努力量最少的渔获物调查的1%，检测到的鱼类种数为传统调查总数的31%～49%.④安庆采样点位于长江中下游长江江豚密度最高的江段，其环境DNA检出率和序列相对丰度在3个采样点中均最高.研究显示：长江水样环境DNA包含水陆复合生态系统的生物多样性信息，利用水样环境DNA宏条形码可检测不同类群的水生和陆生物种；对于鱼类物种检测，环境DNA宏条形码比传统调查方法效率更高，可对传统调查结果进行补充；环境DNA宏条形码生物多样性检测主要受分子标记体系和核酸序列数据库限制，获取全面的物种多样性和资源量信息需要对检测分析方法进行进一步完善. 淡水生态系统为人类文明发展提供了重要资源，然而面临着比陆地和海洋生态系统更严重的威胁[1-2]，是全球生物多样性丧失最严重的区域之一，却缺乏足够的调查研究[3-5].物种是生物多样性的核心组成部分，对物种资源的调查和监测是生物多样性保护的重要基础[6-7]，在全球生物多样性丧失日益严重的背景下，对生物多样性现状全面了解的需求尤为紧迫[8]. 长江是我国淡水资源的宝库，但多年来受人类活动影响，长江生物多样性持续下降，水生态保护形势严峻. 2018年4月，生态环境部、农业农村部和水利部联合发布了《重点流域水生生物多样性保护方案》，明确提出开展长江等重点流域水生生物多样性本底调查的主要目标，以及在流域干流等水域开展鱼类及水生哺乳动物等物种的组成、分布和种群数量进行调查观测的重点任务.同年9月，国务院办公厅发布了《关于加强长江水生生物保护工作的意见》，要求到2020年长江流域重点水域实现常年禁捕，强调提升监测能力，全面开展水生生物资源与环境本底调查，提高监测系统自动化智能化，加强大数据集成分析.生物多样性研究是一项工作量巨大的长期任务，过去零散的调查数据已无法满足当前的研究和管理需求[7]，需要在流域范围内获取更全面更系统的资料，因此对调查方法的科学性和有效性、调查结果的全面性和准确性，以及对大数据的综合分析能力提出了更高的要求. 环境DNA宏条形码(environmental DNA metabarcoding)指从环境样本中提取DNA，利用高通量测序分析获得大量DNA序列，通过序列检索比对检测环境中的多个物种[8]，因其简单高效、灵敏度高等优势获得广泛关注[9].环境DNA宏条形码对物种及其丰度的检测在微生物中已形成标准化的流程，如16S和18S扩增子多样性分析，有力地补充了传统培养方法的缺失[10].进入21世纪初以来，通过环境DNA检测大型生物的技术逐渐兴起，水样环境DNA被用于鱼类和两栖类的特异性物种检测[11-12]. Thomsen等[13]于2012年首次报道了利用水样环境DNA高通量测序进行人工池塘两栖类和鱼类多物种检测，此后环境DNA宏条形码成为水生态系统生物多样性研究的热点，在海洋、湖泊、河流等生境得到应用[14-16].国内研究中，单一物种的环境DNA检测已针对鲢[17]、中华鲟[18]和长江江豚[19-20]在长江流域得到应用，已有通过水样环境DNA克隆测序进行的少数鱼类物种检测初步研究[21]，水样环境DNA宏条形码研究已在海洋环境[22]开展，淡水生态系统环境DNA宏条形码研究在国内引发关注但鲜见报道. 长江中下游具有独特的江湖生态系统，分布有多种重要经济鱼类[23]，也是濒危水生动物的重要栖息地[24]，而长江中下游因流量大、泥沙含量高、物种资源衰退等因素对环境DNA检测提出了巨大挑战[20-21].该研究在长江中下游3个江段(新滩、安庆和芜湖)采集水样，利用通用分子标记建立长江水样环境DNA宏条形码物种检测体系，分析该方法在长江水生物种种类组成和资源量评估中的有效性，旨在探索高敏感度非入侵式的长江生物多样性监测新方法，以期为长江水生态监测体系建设提供技术支撑. 1.研究方法 1.1环境DNA样本采集 于2016年1月在长江中下游干流新滩、安庆、芜湖3个江段各设置1个采样点，每个采样点用全新2 L可密封广口瓶(Nikko，日本亚速旺公司)采集3个2 L表层水样，用0.45 μm聚醚砜滤膜(Pall，美国颇尔公司)真空抽滤，玻璃抽滤漏斗在每次使用前用10%次氯酸钠消毒液浸泡30 min并充分冲洗干净.抽滤完成后，滤膜冷冻保存并尽快送回实验室.用强力水样DNA提取试剂盒(Mobio，美国Mobio实验室)提取滤膜DNA，DNA溶液于-20 ℃下保存. 1.2目的基因片段扩增 利用线粒体细胞色素B简并引物L14912-CYB (5′-TTCCTAGCCATACAYTAYAC-3′; Y=C或T)和H15149-CYB (5′-GGTGGCKCCTCAGAAGGACATTTG KCCYCA-3′; K=G或T, Y=C或T)[25]对环境DNA样本进行PCR扩增，扩增产物片段长度在285 bp左右.该引物的目标位点是在脊椎动物中广泛存在的保守区域，用于河流水样环境DNA鱼类物种克隆测序检测[21, 26].总体积50 μL的反应体系包括4 μL的10×PCR Buffer、1 μL的dNTP (10 mmol/L)、1 μL的正向引物(10 pmol/μL)、1 μL的反向引物(10 pmol/μL)、5 μL的DNA模板和36.5 μL的灭菌双蒸水.反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min、50 ℃退火1 min、72 ℃延伸1.5 min (45个循环)；72 ℃最后延伸7 min. 1.3扩增子高通量测序 采用PCR产物进行文库构建，用Illumina Miseq平台进行高通量测序(深圳华大基因科技服务有限公司)，下机数据经过过滤，滤除低质量的读长序列，得到有效序列.使用软件FLASH v1.2.11进行序列拼接，利用重叠关系将双末端测序得到的成对有效序列组装成一条拼接序列，去除没有重叠关系的序列.利用软件USEARCH v7.0.1090将拼接好的序列聚类为OTU(operational taxonomic unit，操作分类单元)，获得OTU代表序列. 1.4生物信息学数据分析 该研究利用美吉生物云生物信息分析云平台(www.majorbio.com)对测序序列进行生物信息学分析.首先将OTU代表序列在Genbank的核酸序列数据库中进行物种注释，同时利用序列相似性在线检索工具BLAST进行人工校核，除去两端引物序列，核心目标片段100%匹配则被认定为该物种DNA.然后利用分析平台的生物多样性云分析流程v3.0进行交互分析，对注释OTU进行筛选，统计不同分类水平的物种数量、OTU数量、序列数量，计算物种序列相对丰度.
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